基因工程是高中生物核心知識點。基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴格的設計，通過體外DNA重組和轉基因技術，賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。

(DNA重組技術)：體外、定向、分子水平

基本工具：限制性核酸內切酶(限制酶)來自原核細胞，識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。

DNA連接酶： E·coliDNA連接酶(只黏性末端)

T4DNA連接酶(黏、平末端也可但效率低)

載體：質粒、入菌體的衍生物、動植物病毒

條件：①能在宿主細胞內穩(wěn)定存在復制表達

②一種或多種限制酶切點

③標記基因(抗生素抗性基因、熒光基因)

基本操作程序：

1、目的基因的獲?。?人工合成、體內提取)

①從基因文庫獲取

基因組文庫   e.g.cDNA文庫（部分基因文庫）  
 
大小   大   小  
啟動子   有   無  
內含子   有   無  
基因數目   某種生物全部基因   部分基因（基因選擇性表達）  
物種間基因交流   部分可以   可以（mRNA逆轉錄）  

②PCR技術擴增目的基因：模板、Taq酶(熱穩(wěn)定DNA聚合酶)、原料&能量(dXTP)、引物(過量)

五物混合，加熱至90～95℃，DNA解旋，冷卻到55～60℃，引物與互補DNA鏈結合，加熱至70～75℃，

Taq酶從引物起始互補鏈的合成

③人工化學合成：基因比較小，核苷酸序列已知

2、基因表達載體的構建：(基因工程的核心)

啟動子：DNA片段，基因的首端，RNA聚合酶識別和結合的部位

目的基因

終止子：DNA片段 ，基因的尾端

標記基因：鑒別受體細胞中是否含有外源基因，從而將含有外源基因的細胞篩選出來。

(復制原點：僅自我復制的需要，整合到宿主染色體上再表達的不需要)

3、將目的基因導入受體細胞：

轉化：是目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程。

(1)導入植物細胞(體細胞、受精卵)

①農桿菌轉化法(雙子葉植物、裸子植物)

受損，傷口細胞分泌酚類化合物，吸引農桿菌移向，Ti質粒上T-DNA(上插目的基因)轉移至受體細胞整合到受體細胞染色體上

②基因槍法(單子葉植物)

③花粉管通道法

(2)導入動物細胞(受精卵)顯微注射技術

(3)導入微生物細胞

優(yōu)點：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對較少、對人體無害(大腸桿菌)

步驟：Ca2+ 處理細胞，使其成為感受態(tài)細胞，重組表達載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細胞混合，在一定的溫度下促進感受態(tài)細胞吸收DNA分子

4、目的基因的檢測與鑒定：

①DNA分子雜交技術：轉基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因(目的基因是否進入原核細胞)

轉基因生物的染色體DNA(原核質粒)+有同位素標記的目的基因

②RNA分子雜交技術：目的基因是否轉錄出了mRNA 轉基因生物的mRNA+有同位素標記的目的基因

③抗原-抗體雜交：目的基因是否翻譯成蛋白質 轉基因生物的蛋白質+相應的抗體

④個體生物學水平的鑒定：抗蟲抗病的接種實驗

(自然界不存在的蛋白質)

預期蛋白質功能，設計蛋白質結構，推測氨基酸序列，找對應的脫氧核苷酸序列，人工合成基因，基因工程，蛋白質產品

(一)植物細胞工程：

1、植物組織培養(yǎng)技術：

(1)原理：植物體細胞的全能性

(2)過程：離體的植物器官、組織或細胞，脫分化(避光)，愈傷組織(未分化，薄壁細胞)，再分化，根芽，細胞分裂分化，植株

(3)條件：無菌(防止微生物污染)

營養(yǎng)(無機鹽、有機物、水)

激素(生長素、細胞分裂素，=1誘導脫分化，>1生根，<1生芽，激素杠桿)

離體

2、植物體細胞雜交技術：克服生殖隔離(不同生物遠緣雜交不親和的障礙)

(二)動物細胞工程：

1、動物細胞培養(yǎng)：

(1)原理：一些動物細胞在體外可生長增殖

(2)過程：

動物組織塊，剪碎，胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理，分散成單個細胞，制成細胞懸液

原代培養(yǎng)：轉入培養(yǎng)瓶，細胞貼壁(培養(yǎng)瓶內壁光滑無毒易于貼附)，細胞有絲分裂，接觸抑制

胰蛋白酶處理

分瓶繼續(xù)傳代培養(yǎng)(10代以內以保持正常的二倍體核型，50代以上癌細胞)

(3)條件：

無菌無毒的環(huán)境：用具無菌處理;培養(yǎng)液中加抗生素;定期更換培養(yǎng)液(清除代謝產物，防止細胞代謝產物積累對細胞自身造成危害)

營養(yǎng)：糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量元素、血清血漿

溫度和pH：動物體溫(哺乳36+ -0.5℃)，pH=7.2-7.4

氣體環(huán)境：95%空氣+5%CO2(維持培養(yǎng)液pH)

2、動物體細胞核移植技術(克隆動物)胚胎細胞核移植(易) 移入去核卵母細胞

3、動物細胞融合(細胞雜交)：除物理化學法外，還可用滅活的病毒誘導

4、雜交瘤技術(生產單克隆抗體)

(1)傳統(tǒng)方法：向動物體內反復注射某種抗原，產生抗體后從血清中分離，抗體產量低純度低特異性差

(2)單克隆抗體優(yōu)點：特異性強，靈敏度高，并能大量制備

早期胚胎或配子水平

(一)體內受精和早期胚胎發(fā)育：

1、精子的發(fā)生：睪丸的曲細精管內，初情期開始

變形：細胞核—精子頭，高爾基體—頂體，中心體—尾，線粒體—尾的基部的線粒體鞘，

其他物質—原生質滴向后脫落

2、卵子的發(fā)生：卵巢及輸卵管

胎兒性別分化后：卵原細胞有絲分裂，并變成初級卵母細胞，被卵泡細胞包圍形成卵泡

卵泡的形成和在卵巢內的儲備在出生前(胎兒時期完成)

初情期后：初級卵母細胞——次級卵母細胞和第一極體——減二中期?！炎印O體

馬狗排卵 豬牛羊排卵 受精

卵子是否受精的標志：卵黃膜和透明帶的間隙可以觀察到兩個極體

3、受精：輸卵管內完成

(1)精子獲能

(2)卵子的準備：達到減數第二次分裂中期

(3)受精：