基因工程是高中生物核心知識(shí)點(diǎn)?；蚬こ淌侵赴凑杖藗兊脑竿?，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。

(DNA重組技術(shù))：體外、定向、分子水平

基本工具：限制性核酸內(nèi)切酶(限制酶)來自原核細(xì)胞，識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。

DNA連接酶： E·coliDNA連接酶(只黏性末端)

T4DNA連接酶(黏、平末端也可但效率低)

載體：質(zhì)粒、入菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒

條件：①能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在復(fù)制表達(dá)

②一種或多種限制酶切點(diǎn)

③標(biāo)記基因(抗生素抗性基因、熒光基因)

基本操作程序：

1、目的基因的獲?。?人工合成、體內(nèi)提取)

①從基因文庫獲取

基因組文庫   e.g.cDNA文庫（部分基因文庫）  
 
大小   大   小  
啟動(dòng)子   有   無  
內(nèi)含子   有   無  
基因數(shù)目   某種生物全部基因   部分基因（基因選擇性表達(dá)）  
物種間基因交流   部分可以   可以（mRNA逆轉(zhuǎn)錄）  

②PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因：模板、Taq酶(熱穩(wěn)定DNA聚合酶)、原料&能量(dXTP)、引物(過量)

五物混合，加熱至90～95℃，DNA解旋，冷卻到55～60℃，引物與互補(bǔ)DNA鏈結(jié)合，加熱至70～75℃，

Taq酶從引物起始互補(bǔ)鏈的合成

③人工化學(xué)合成：基因比較小，核苷酸序列已知

2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建：(基因工程的核心)

啟動(dòng)子：DNA片段，基因的首端，RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位

目的基因

終止子：DNA片段 ，基因的尾端

標(biāo)記基因：鑒別受體細(xì)胞中是否含有外源基因，從而將含有外源基因的細(xì)胞篩選出來。

(復(fù)制原點(diǎn)：僅自我復(fù)制的需要，整合到宿主染色體上再表達(dá)的不需要)

3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：

轉(zhuǎn)化：是目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。

(1)導(dǎo)入植物細(xì)胞(體細(xì)胞、受精卵)

①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(雙子葉植物、裸子植物)

受損，傷口細(xì)胞分泌酚類化合物，吸引農(nóng)桿菌移向，Ti質(zhì)粒上T-DNA(上插目的基因)轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞整合到受體細(xì)胞染色體上

②基因槍法(單子葉植物)

③花粉管通道法

(2)導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞(受精卵)顯微注射技術(shù)

(3)導(dǎo)入微生物細(xì)胞

優(yōu)點(diǎn)：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少、對(duì)人體無害(大腸桿菌)

步驟：Ca2+ 處理細(xì)胞，使其成為感受態(tài)細(xì)胞，重組表達(dá)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合，在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子

4、目的基因的檢測(cè)與鑒定：

①DNA分子雜交技術(shù)：轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因(目的基因是否進(jìn)入原核細(xì)胞)

轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA(原核質(zhì)粒)+有同位素標(biāo)記的目的基因

②RNA分子雜交技術(shù)：目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA 轉(zhuǎn)基因生物的mRNA+有同位素標(biāo)記的目的基因

③抗原-抗體雜交：目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì) 轉(zhuǎn)基因生物的蛋白質(zhì)+相應(yīng)的抗體

④個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定：抗蟲抗病的接種實(shí)驗(yàn)

(自然界不存在的蛋白質(zhì))

預(yù)期蛋白質(zhì)功能，設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，推測(cè)氨基酸序列，找對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列，人工合成基因，基因工程，蛋白質(zhì)產(chǎn)品

(一)植物細(xì)胞工程：

1、植物組織培養(yǎng)技術(shù)：

(1)原理：植物體細(xì)胞的全能性

(2)過程：離體的植物器官、組織或細(xì)胞，脫分化(避光)，愈傷組織(未分化，薄壁細(xì)胞)，再分化，根芽，細(xì)胞分裂分化，植株

(3)條件：無菌(防止微生物污染)

營養(yǎng)(無機(jī)鹽、有機(jī)物、水)

激素(生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素，=1誘導(dǎo)脫分化，>1生根，<1生芽，激素杠桿)

離體

2、植物體細(xì)胞雜交技術(shù)：克服生殖隔離(不同生物遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙)

(二)動(dòng)物細(xì)胞工程：

1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)：

(1)原理：一些動(dòng)物細(xì)胞在體外可生長(zhǎng)增殖

(2)過程：

動(dòng)物組織塊，剪碎，胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理，分散成單個(gè)細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液

原代培養(yǎng)：轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶，細(xì)胞貼壁(培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)壁光滑無毒易于貼附)，細(xì)胞有絲分裂，接觸抑制

胰蛋白酶處理

分瓶繼續(xù)傳代培養(yǎng)(10代以內(nèi)以保持正常的二倍體核型，50代以上癌細(xì)胞)

(3)條件：

無菌無毒的環(huán)境：用具無菌處理;培養(yǎng)液中加抗生素;定期更換培養(yǎng)液(清除代謝產(chǎn)物，防止細(xì)胞代謝產(chǎn)物積累對(duì)細(xì)胞自身造成危害)

營養(yǎng)：糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因子、無機(jī)鹽、微量元素、血清血漿

溫度和pH：動(dòng)物體溫(哺乳36+ -0.5℃)，pH=7.2-7.4

氣體環(huán)境：95%空氣+5%CO2(維持培養(yǎng)液pH)

2、動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)(克隆動(dòng)物)胚胎細(xì)胞核移植(易) 移入去核卵母細(xì)胞

3、動(dòng)物細(xì)胞融合(細(xì)胞雜交)：除物理化學(xué)法外，還可用滅活的病毒誘導(dǎo)

4、雜交瘤技術(shù)(生產(chǎn)單克隆抗體)

(1)傳統(tǒng)方法：向動(dòng)物體內(nèi)反復(fù)注射某種抗原，產(chǎn)生抗體后從血清中分離，抗體產(chǎn)量低純度低特異性差

(2)單克隆抗體優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，靈敏度高，并能大量制備

早期胚胎或配子水平

(一)體內(nèi)受精和早期胚胎發(fā)育：

1、精子的發(fā)生：睪丸的曲細(xì)精管內(nèi)，初情期開始

變形：細(xì)胞核—精子頭，高爾基體—頂體，中心體—尾，線粒體—尾的基部的線粒體鞘，

其他物質(zhì)—原生質(zhì)滴向后脫落

2、卵子的發(fā)生：卵巢及輸卵管

胎兒性別分化后：卵原細(xì)胞有絲分裂，并變成初級(jí)卵母細(xì)胞，被卵泡細(xì)胞包圍形成卵泡

卵泡的形成和在卵巢內(nèi)的儲(chǔ)備在出生前(胎兒時(shí)期完成)

初情期后：初級(jí)卵母細(xì)胞——次級(jí)卵母細(xì)胞和第一極體——減二中期?！炎?、極體

馬狗排卵 豬牛羊排卵 受精

卵子是否受精的標(biāo)志：卵黃膜和透明帶的間隙可以觀察到兩個(gè)極體

3、受精：輸卵管內(nèi)完成

(1)精子獲能

(2)卵子的準(zhǔn)備：達(dá)到減數(shù)第二次分裂中期

(3)受精：